Gold Line
GOLD LINE здоровье питомца важнее
всего золота мира
телефон горячей линии 8 (800) 234 20 01

Распространение и встречаемость возбудителей трансмиссивных заболеваний у здоровых собак в России

2018-04-17

к.б.н. Коняев Сергей Владимирович, ВЛ «VET UNION», г. Москва, Нагатинская набережная, стр.3, 117105, s.konyaev@yahoo.com

к.б.н. Фоменко Наталия Владимировна, АО Вектор-Бест, г. Новосибирск, Пасечная 3, 630117, FomenkoN@vector-best.ru,

к.б.н. Акимов Иван Алексеевич, АО Вектор-Бест, г. Новосибирск, Пасечная 3, 630117, Akimov@vector-best.ru,

к.б.н. Иванов Михаил Константинович, АО Вектор-Бест, г. Новосибирск, Пасечная 3, 630117, Институт молекулярной и клеточной биологии, ivanovmk@vector-best.ru

На территории России по-прежнему недостаточно изученными остаются трансмиссивные заболевания собак и кошек. Остаётся неясной география очагов сердечного и подкожного дирофиляриозов, имеются лишь разрозненные данные о напряжённых очагах на юге России [1,2] и в Москве [3]. В умеренной зоне России широко распространён подкожный дирофиляриоз [4]. Имеются лишь описание единичных находок других видов филяриат – Onhocerca lupi, Dipetalonema и др. [5]. Бабезиоз собак является одной из важнейших проблем в летний период времени практически на всей территории страны, но при этом практически не изучены особенности этиологии данного паразитоза в России. Вместе с тем, многообразие клинических форм, различия в успешности лечения препаратами имидокарба и дименазена, а также единичные публикации в научной литературе свидетельствуют о циркуляции на территории разных видов бабезий [6]. Согласно данным исследования клещей медицинской службой широкое распространение имеет Anaplasma phagocytophilum, вместе с тем её встречаемость у собак практически не изучена. Эрлихиозы по-прежнему являются для ветеринарных врачей редко диагностируемыми заболеваниями.

Целью настоящего исследования являлось продемонстрировать спектр патогенов вызывающих трансмиссивные заболевания собак, их встречаемость в России. Изучить видовой состав Babesia, Anaplasma, Ehrlichia и филяриатных нематод собак паразитирующих у животных в России. Определить встречаемость перечисленных патогенов у здоровых собак, поступающих в ветеринарные клиники четырёх городов: Москвы, Екатеринбурга, Краснодара и Симферополя.

Материалы и методы

Материалом для данного исследования послужила кровь собак поступающих для рутинных мероприятий (вакцинации, кастрации и др.) в ветеринарные клиники, признанных здоровыми на основании анамнеза и клинического осмотра. Сбор материала осуществлялся в клиниках: «ВетДоктор» г. Екатеринбург, «Белый Клык» г. Москва, «Большая Медведица», г. Краснодар, «24 часа» г. Симферополь. Образцы отбирались случайным путём без сопоставления с анамнезом жизни, историй перенесённых заболеваний, происхождения, истории путешествий животных, по мере их поступления в лаборатории. Из Севастополя материал поступал из разных клиник, только при указании в бланке анамнеза: «Здорово». Кровь отбиралась из вены в пробирку с ЭДТА для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также комплементарно в пробирку с активатором свёртывания для получения сыворотки и проведения иммуноферментного анализа в твердой фазе (тИФА). Всего было исследовано 500 проб: 200 пар «кровь/сыворотка» из г. Москва и по 100 проб из Екатеринбурга, Краснодара и суммарно 100 из городов Севастополь и Симферополь. Для установления видового разнообразия филяриатных нематод, циркулирующих на территории России, дополнительно было собрано 500 проб крови от собак с территории Центрального, Южного, Уральского федеральных округов и Крыма.

Материал поступал в ветеринарную лабораторию «VET UNION», (г. Москва) «ослеплённым», с нумерацией предусматривающей только сопоставление пар «кровь-сыворотка». Выделенные из крови геномные нуклеиновые кислоты исследовали с низкоспецифичными праймерами к ДНК протобактерий Erhlichia и Anaplasma, к простейшим рода Babesia. Сыворотка исследовалась в тИФА на антитела IgG к Ehrlichia canis (Ehrlichia canis, Agrolabo, Biopronix) и к Anaplasma phagocytophilum (Anti-Anaplasma phagocytophilum ELISA Dog IgG, EUROIMMUN) с использованием иммуноферментного микропланшетого автоматического анализатора INFINITE F50, (Tecan, Австрия).

Положительными в ИФА на антитела к Ehrlichia canis считали пробы имеющие  коэффициент оптической плотности более 1.1, отрицательным менее 0.9, сомнительным от 0.9 до 1.1. В ИФА на антитела к Anaplasma phagocytophilum результат рассматривали как положительный - выше или равный 1.1, сомнительный - равный или более 0.8, но менее 1.1., отрицательный - менее 0.8.

Для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцетной детекцией продуктов в режиме реального времени использовали готовые наборы реагентов согласно инструкции производителя. Были использованы регистрирующие амплификаторы CFX96. ООО "Био-Рад Лаборатории", США. При получении положительной реакции на ДНК Anaplasma/Ehrlichia (V-5460 РеалБест-Вет ДНК Anap.spp, Ehrlichia spp.) проводились два варианта ПЦР с видоспецифичными праймерами для выявления ДНК Anaplasma platys, Anaplasma phagocуtophilym, Ehrlichia canis (Дуплекс - V-5469 РеалБест-Вет ДНК Anaplasma platys/ Anaplasma phagocytophilum). Полученные положительные реакции в тИФА сопоставляли с результатами ПЦР.

При выявлении в образцах крови ДНК бабезий с помощью (V-5461 РеалБест-Вет ДНК Babes.spp), полученные пробы направлялись для дальнейшего исследования на базе лаборатории АО «Вектор-Бест», (г. Новосибирск), где проводили секвенирование с последующим анализом и сопоставлением полученных последовательностей с хранящимся в GenBank. Для определения видовой принадлежности бабезий использовались стандартные пары праймеров опубликованных ранее (18S rRNA BabseqF, BabseqR). Для выявления ДНК микрофилярий видов отряда Filariata, кроме Dirofilaria repensи D. immitis проводили ПЦР с низкоспецифическими праймерами к ДНК нематод подотряда с последующим секвенированием маркерных генов и сравнением их последовательностей с ранее известными.

Результаты исследования

Выявление ДНК протобактерий и антител к ним

Ehrlichia spp.

Всего при исследовании сывороток здоровых собак в ИФА, было получено 41 положительных и 14 сомнительных  реакции.

Единственный случай выявления в ПЦР заражения Ehrlichia canis собаки в Москве был серонегативным. Из Краснодара было представлено 14 положительных в ИФА сывороток, два положительных результата совпали с обнаружением ДНК Ehrlichia canis в образцах. В Екатеринбурге было выявлено 5 положительных образцов по антителам к Ehrlichia canis, при этом не было выявлено ДНК этих бактерий в парном образце крови.  В Крыму 10 образцов было положительно в ИФА. Один образец был положителен в ПЦР на Ehrlichia canis, но отрицателен по антителам к ней и положителен по ДНК и антителам к Anaplasma phagocytophilum одновременно.  Один образец был положителен по антителам против Anaplasma phagocytophilum и Ehrlichia canis, но при этом отрицателен по ДНК к этим бактериям.

В ПЦР были получены 4 положительных результата Ehrlichia canis, по одному случаю в Крыму и Москве, два в Краснодаре. Таким образом, средняя заражённость составила 0,8% (n=500).

Anaplasmaspp.

В Крыму выявлен единственный случай заражения Anaplasma platys.

Было получено 5 положительных реакций в ИФА сывороток от собак из Москвы, что составило 6% от исследованных образцов, при этом все результаты по ПЦР были отрицательными. 2 образца показали сомнительный результат, также при отрицательном ПЦР.

Образцы из Екатеринбурга все были отрицательны в ИФА на антитела к анаплазме, а также в ПЦР. В Краснодаре – 1 образец сыворотки был положительным, при отрицательном результате ПЦР. Образцы из Крыма были положительны в двух случаях по антителам, один из которых подтверждён в ПЦР.

ИФА для выявления антител против Anaplasma phagocytophilum обладает низкой специфичностью (91% для использованного в исследовании набора), что объясняет большое количество положительных реакций неподтверждаемых обнаружением ДНК анаплазм. Вместе с тем, высокая чувствительность (97%) позволяет выявлять, в том числе случаи, когда количество анаплазм в лейкоцитах низкое при латентной инфекции. Отсутствие антител при выявлении ДНК возбудителя возможно на ранних этапах развития инфекции.

По ПЦР всего выявлено 1 случай заражения Anaplasma phagocytophilum0.2% (n=500).

 

Выявление кровепаразитов

Babesiaspp.

Нами было выявлено 18 случаев носительства, либо пробы были собраны у животных в инкубационный период болезни, бабезиоза у собак. По одной последовательности ДНК принадлежащие Babesia gibsoni получены из г. Москва и г. Симферополь, и две из г. Краснодара. В остальных 14 случаях было выявлено ДНК Babesia canis canis (один случай в Москве, пять в Краснодаре и восемь в Екатеринбурге). Таким образом, общая заражённость бабезиями составила 3.6%, большую часть которой приходится на B. canis 2.8%. Бабезия Гибсона была представлена значительно реже – 0.8% бессимптомных случаев. Дальнейшее развитие инвазии у животных не отслеживалось.

Микрофилярии

Методом ПЦР было выявлено 54 случая заражения собак Dirofilaria spp., что составило 10,8% от исследованных животных. В Москве заражённость составила 10,5%, в Екатеринбурге 8%, в Краснодаре 18%, в Симферополе 7%.

В связи с выявлением большого количества проб положительных по дирофиляриозу было проведено дополнительное исследование ещё 500 проб животных из федеральных округов с праймерами к Filariata spp. с последующим секвенированием положительных образцов. В полученной выборке заражённость была значительно ниже.

ПЦР выявила 28 случаев заражения собак дирофиляриями Dirofilaria spp., то есть у 5,6% исследованных животных. Зараженность подкожной дирофилярией D. repens (n=14) и сердечной D. immitis (n=14) была равной, но различалась по распространённости. Подкожный дирофиляриоз был выявлен в Москве (n=12) и Краснодаре (n=2), не выявлено положительных проб в Крыму и Екатеринбурге. Сердечный дирофиляриоз выявлен у собак в Крыму (n=1), Краснодаре (n=8) и Москве (n=5).

Повторное исследование проб в ПЦР с праймерами к Filariata выявила ДНК паразитов в трёх пробах не относящихся к дирофиляриям. Секвенирование полученных образцов по 28S показало, что полученные фрагменты ДНК невозможно соотнести ни с одной известной последовательностью хранящейся в GenBank. 91% гомологии с образцами Wuchereria bancrofti. Учитывая генетическую дистанцию между видами внутри данной группы, обнаруженные последовательности сложно отнести к какому-либо известному роду филярий представленных в GenBank.

Табл. 1. Встречаемость трансмиссивных патогенов в крови собак по положительным результатам ПЦР или ИФА

 

 

Регион исследования

 

Всего

Москва

Краснодар

Екатеринбург

Симферополь

Исследованных проб

500

200

100

100

100

Вид патогена

 

Положительных проб

Anaplasma platys

1

0

0

0

1

A. phagocуtophilym

1

0

0

0

1

Babesia canis canis

14

1

5

0

8

Babesia gibsoni

4

1

2

0

1

Ehrlichia canis

4

1

2

0

1

Dirofilaria spp.

54

21

18

8

7

IgG к A. phagocуtophilym

8

5

1

0

2

IgG к Ehrlichia canis

41

12

14

5

10

Ehrlichia / Anaplasma spp. – виды указанных родов ближе неопределённые

 

Табл. 2. Встречаемость дирофиляриозов у собак в федеральных округах России по результатам ПЦР

 

Всего

ЦФО

ЮФО

УФО

Крым

Исследовано проб

500

200

100

100

100

Вид патогена

Положительных проб

Dirofilaria immitis

14

5

8

0

1

Dirofilaria repens

14

12

2

0

0

 

Табл. 3 Выявлено положительных в процентном отношении

 

 

Регион исследования

 

Всего

Москва

Краснодар

Екатеринбург

Симферополь

Исследованных проб

500

200

100

100

100

Вид патогена

 

Процент положительных животных

Anaplasma platys

0.2

0

0

0

1

A. phagocуtophilym

0.2

0

0

0

1

Babesia canis canis

2.8

0.5

5

0

8

Babesia gibsoni

0.8

0.5

2

0

1

Ehrlichia canis

0.8

0.5

2

0

1

Dirofilaria spp.

10.8

10.5

18

8

7

IgG к A. phagocуtophilym

1.6

2.5

1

0

2

IgG к Ehrlichia canis

8.2

0.6

14

5

10

Конфликт интересов

Исследование проведено при финансовой поддержке компании «Байер». Авторы выражают искреннюю благодарность клиническим патологам ветеринарных клиник принявших участие в сборе материала для исследования.

Список литературы

  1. Артамонова А.А., Нагорный С.А., и др. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. – 1996. - №1 – С.44.
  2. Нагорный С.А., Ермакова Л.А. и др. //Медицинская паразитология и паразитарные болезни. – 2007. - №2. –С.42-46.
  3. Ястреб В.Б. Эпизоотическая ситуация по дирофиляриозу собак в Московском регионе // Российский паразитологический журнал, 2008. - №3. -  С. 1 – 6
  4. Сергиев В.П., Супряга В.Г., Дарченкова Н.Н., Л.А. Жукова, Иванова Т.Н. Дирофиляриоз человека в России // Российский паразитологический журнал, 2012. - №4. – С.50-64
  5. Козлов Д.П. Определитель гельминтов хищных млекопитающих СССР. / Д.П. Козлов. М.: «Наука», 1977.- 276 с.
  6. Карташов С.И., Ермаков А.М., Ключников А.Г., Миронова П.Л., Миронова А.А., Ярошенко Н.В., Бойко В.П.  Бабезиоз собак: новые экологические, молекулярно-генетические и клинико-лабораторные аспекты // Ветеринария Кубани, 2010. - №5. – С. 22-24